Identifikasi Senyawa Organik III: NMR dan Spektrometri Massa

Setelah pada bagian Identifikasi Senyawa Organik II, telah dibahas metode spektroskopi dengan ultraviolet (UV) untuk mengetahui transisi elektronik senyawaan organik, serta inframerah (IR) untuk mengetahui gugus fungsi yang terdapat dalam senyawa tersebut, kini akan disajikan metode spektroskopi lain yang turut membantu dalam elusidasi struktur senyawa organik.

Resonansi Magnetik Inti (Nuclear Magnetic Resonance; NMR)

Nuclear Magnetic Resonance (NMR) adalah salah satu metode analisis yang paling mudah digunakan untuk menentukan struktur dari komponen alami dan sintetik yang baru, kemurnian dari komponen, dan arah reaksi kimia sebagaimana hubungan komponen dalam larutan yang dapat mengalami reaksi kimia. Spektroskopi resonansi magnetik nuklir (NMR) memberikan gambaran mengenai jenis atom, jumlah, maupun lingkungan atom hidrogen (1H NMR) maupun karbon (13C NMR).

Pada spektrum hidrogen NMR menghadirkan beberapa resonansi yang menjelaskan:

1. bahwa molekul yang dipelajari mengandung hidrogen. 
2. jumlah pita dalam spektrum menunjukkan bagaimana beberapa posisi yang berbeda pada molekul dimana hidrogen melekat/menempel. Frekuensi dari beberapa resonansi utama pada spektrum NMR menunjukkan perubahan kimia. Ini sangat penting untuk menduga bagian dari spektrum NMR yang mengandung informasi tentang lingkungan masing-masing atom hidrogen dan struktur dari komponen yang dipelajari. 
3. bahwa sebuah spektrum NMR menentukan perbandingan luas/daerah pita yang berbeda, ini menjelaskan jumlah atom hidrogen yang relatif yang keluar pada masing-masing posisi pada molekul yang diperoleh. 

Inti-inti atom unsur-unsur dapat dikelompokkan sebagai mempunyai spin atau tidak mempunyai spin. Suatu inti berspin akan menimbulkan medan magnet kecil, yang ditunjukkan oleh suatu momen magnet nuklir, berupa suatu vektor. Diantara inti-inti yang lebih umum yang memiliki spin dan tidak memiliki spin antara lain :

Inti proton (atom hidrogen) dan karbon (karbon 13) mempunyai sifat-sifat magnet. Bila suatu senyawa mengandung hidrogen atau karbon diletakkan dalam bidang magnet yang sangat kuat dan diradiasi dengan radiasi elektromagnetik maka inti atom hidrogen dan karbon dari senyawa tersebut akan menyerap energi melalui suatu proses absorpsi yang dikenal dengan resonansi magnetik. Absorpsi radiasi terjadi bila kekuatan medan magnet sesuai dengan frekuensi radiasi elektromagnetik. Proton tunggal 1H adalah isotop yang paling penting dalam hydrogen. Isotop ini melimpah hampir 100% dan jaringan hewan mengandung 80% air. 1H memproses momen magnetik yang besar dari nuclei yang penting secara biologi. Ketika pada medan magnet konstan, frekuensi NMR dari nuclei hanya bergantung pada momen magnetnya, frekuensi 1H paling tinggi pada spekrometer yang sama. Sebagai contoh, pada spekrometer 360 MHz untuk 1H, frekuensi untuk 31P adalah 145,76 MHz dan untuk 13C adalah sekitar 90 MHz.

Dasar dari spektroskopi NMR adalah absorpsi radiasi elektromagnetik dengan frekuensi radio oleh inti atom. Frekuensi radio yang digunakan berkisar dari 0,1 sampai dengan 100 MHz. Bahkan, baru-baru ini ada spektrometer NMR yang menggunakan radio frekuensi sampai 500MHz. Skema alat NMR ditunjukkan pada gambar dibawah:

Skema Alat Spektroskopi Resonansi Magnetik Inti (NMR)

Alat NMR di Laboratorium Colorado University, USA

Penemuan pergeseran kimia memberikan berbagai kemajuan dalam kimia. Sejak itu spektroskopi NMR telah menjadi alat yang paling efektif untuk menentukan struktur semua jenis senyawa. Pergeseran kimia dapat dianggap sebagai ciri bagian tertentu struktur. Misalnya, pergeseran kimia proton dalam gugus metil sekitar 1 ppm ataupun struktur bagian lainnya. Untuk lebih lanjut, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3, dalam hal spektra ¹H NMR, intensitas signal terintegrasi sebanding dengan jumlah inti yang relevan dengan signalnya. Hal ini akan sangat membantu dalam penentuan struktur senyawa organik.

Tergantung pada lingkungan kimia lokal, proton yang berbeda dalam molekul beresonansi pada frekuensi yang sedikit berbeda. Karena kedua hal ini pergeseran frekuensi dan frekuensi resonansi dasar secara langsung proporsional dengan kekuatan medan magnet, pergeseran ini dikonversi menjadi nilai bidang independen berdimensi yang dikenal sebagai pergeseran kimia. Pergeseran kimia dilaporkan sebagai ukuran relatif dari beberapa frekuensi resonansi referensi. (Untuk, inti 1H 13C, dan 29Si, TMS (Tetra Metil Silan) umumnya digunakan sebagai referensi.) Perbedaan antara frekuensi sinyal dan frekuensi referensi dibagi oleh frekuensi dari sinyal referensi untuk memberikan pergeseran kimia.

 

Pergeseran frekuensi sangat kecil dibandingkan dengan frekuensi NMR mendasar. Sebuah pergeseran frekuensi mungkin khas 100 Hz, dibandingkan dengan frekuensi fundamental NMR 100 MHz, sehingga pergeseran kimia umumnya dinyatakan dalam bagian per juta (ppm). Untuk mendeteksi perbedaan frekuensi kecil seperti medan magnet yang diterapkan harus konstan seluruh volume sampel. Resolusi tinggi spektrometer NMR menggunakan shims untuk menyesuaikan homogenitas medan magnet untuk bagian per miliar (ppb) dalam volume dari beberapa sentimeter kubik. Contoh pergeseran kimia: spektrum NMR menunjukkan puncak hexaborane B6H10 bergeser dalam frekuensi, yang memberikan petunjuk dengan struktur molekul.

 

Pergeseran Kimia pada Heksaborana (B6H10)

 Gambar dibawah ini memperlihatkan wilayah pergeseran kimia pada 1H-NMR dan 13C-NMR. Perhatikan bahwa TMS (standar) memiliki nilai pergeseran kimia sebesar 0,0.

Dan berikut disajikan nilai pergeseran kimia 1H-NMR dan 13C-NMR sejumlah gugus pada senyawaan organik. Tabel di atas untuk 1H-NMR sementara tabel di bawahnya untuk 13C-NMR.

Aplikasi NMR

1. Bidang kedokteran

Spektroskopi NMR merupakan alat yang dikembangkan dalam biologi struktural. NMR manjadi sebuah teknik alternatif selain kristalografi X-Ray, untuk memperoleh informasi struktur dan resolusi dinamik atomik dan studi interaksi molekuler dari makromolekul biologi pada kondisi larutan secara fisiologi. Usaha sangat penting untuk memperluas aplikasi NMR untuk sistem molekul yang lebih besar, karena jumlah yang lebih besar secara biologi dibutuhkan kompleks makromolekul dan makromolekuler yang memiliki massa molekuler melebihi range yang sacara prakis digunakan untuk spektroskopi NMR konvensional dalam larutan. Peningkatan ukuran ini memberikan batasan, contohnya, penentuan struktur protein yang tidak dapat dikristalkan, termasuk membran protein integral, penelitian interaksi molekuler melibatkan molekul besar dan penghimpunan makromolekuler, dan penentuan struktur dari oligonukleotida yang lebih besar dan kompleks dengan protein.

2. Bidang Biologi Molekuler

Untuk protein dan protein komplek dengan massa molekuler sekitar 25-30 kDa kualitas spektra menurun dengan cepat membatasi mayor A ketika bekerja dengan makromolekul besar yang berasal dari kecepatan relaksasi tinggi signal NMR, menyebabkan garis tajam yang melebar, yang berpindah menuju resolusi spektra yang lebih sedikit dan perbandingan signal-to-noise yang rendah. Banyak peningkatan kualitas spektra NMR dari biologi makromolekuler dengan massa molekuler sekitar diatas 25 kDa dapat diperoleh dengan deuterasi, teknik yang telah dipakai dalam biologi NMR selama lebih dari 30 tahun. Dikombinasikan dengan label 15N dan 13C, label 2H mengalami pemulihan yang sangat mengesankan sekitar 10 tahun yang lalu dan telah menjadi alat yang paling penting untuk menentukan struktur yang lebih besar dalam larutan.

3. Studi Larutan NMR Pada Protein Membran

Protein membran berperan pada beberapa fungsi fisiologi yang penting, dan dalam membentuk kunci target obat-obatan. Studi struktural protein membran oleh X-ray crystallography atau oleh NMR spektrokopi lebih sulit dari pada untuk protein yang dapat dilarutkan. Karena sistem membran yang nyata terlalu besar untuk diteliti dengan ekperimen larutan NMR, protein membran sering diencerkan dalam detergen micelles. Dari system micellar, spektra dapat diperoleh menggunakan TROSY (Transverse Relaxation-Optimized Spectroscopy). Membran protein dalam detergen/lemak micelles menghasilkan sedikit resonansi NMR dan signal overlap berkurang daripada protein globular dari massa molekuler yang sama. Walaupun molekul detergen dapat menunjukkan fraksi yang besar dari keseluruhan massa yang besar dari pencampuran micelles, pelabelan isotop yang sesuai seperti tanda 13C, 15N dari protein dan atau menggunakan detergen deuterasi, memastikan bahwa signal NMR protein dapat dideteksi dengan besar atau tanpa interferensi dari signal molekul detergen. NMR pada biologi melekuler dilakukan pada sample dalam bentuk larutan yang terlebih dahulu dilakukan pemurnian atau ekstraksi. Dengan NMR dapat diketahui struktur molekulernya dan perubahan yang terjadi ketika mendapat ganguan dari luar (rangsangan, penyakit atau penambahan zat lain).

Spektrometri Massa (Mass Spectrometry; MS)

Spektometer massa adalah suatu instrumen yang dapat menyeleksi molekul-molekul gas bermuatan berdasarkan massa atau beratnya. Teknik ini tidak dapat dilakukan dengan spektroskopi, akan tetapi nama spektroskopi dipilih disebabkan persamaannya dengan pencatat fotografi dan spektrum garis optik. Umumnya spektrum massa diperoleh dengan mengubah senyawa suatu sampel menjadi ion-ion yang bergerak cepat yang dipisahkan berdasarkan perbandingan massa terhadap muatan. 

Proses ionisasi menghasilkan partikel-partikel bermuatan positif, dimana massa terdistribusi adalah spesifik terhadap senyawa induk. Selain untuk penentuan stuktur molekul, spektum massa dipakai untuk penentuan analisis kuantitatif. Jika didapat data IR dan NMR yang cukup lengkap, maka MS ini dapat digunakan untuk konfirmasi dengan memperhatikan bobot molekul dan kemungkinan rumus strukturnya.

Garis besar tentang apa yang terjadi dalam alat spektrometer massa ditunjukkan pada gambar berikut ini. Penjelasan mengenai cara kerja alat disampaikan pada keterangan dibawah gambar.

Skema Alat Spektrometer Massa (MS)

Urutan cara kerja alat Spektrometer Massa (MS) adalah sebagai berikut :

• Tahap pertama : Ionisasi

Atom di-ionisasi dengan ‘mengambil’ satu atau lebih elektron dari atom tersebut supaya terbentuk ion positif. Ini juga berlaku untuk unsur-unsur yang biasanya membentuk ion-ion negatif (sebagai contoh, klor) atau unsur-unsur yang tidak pernah membentuk ion (sebagai contoh, argon). Spektrometer massa ini selalu bekerja hanya dengan ion positif.

• Tahap kedua : Percepatan

Ion-ion tersebut dipercepat supaya semuanya mempunyai energi kinetik yang sama.

• Tahap ketiga : Pembelokan

Ion-ion tersebut dibelokkan dengan menggunakan medan magnet, pembelokan yang terjadi tergantung pada massa ion tersebut. Semakin ringan massanya, akan semakin dibelokan. Besarnya pembelokannya juga tergantung pada besar muatan positif ion tersebut. Dengan kata lain, semakin banyak elektron yang ‘diambil’ pada tahap 1, semakin besar muatan ion tersebut, pembelokan yang terjadi akan semakin besar.

• Tahap keempat : Pendeteksian

Sinar-sinar ion yang melintas dalam mesin tersebut dideteksi dengan secara elektrik.

Mekanisme fragmentasi

Beberapa aturan sederhana untuk fragmentasi ion adalah sebagai berikut:

1. Jika salah satu ikatan ganjil yang memotong ion elektron, bila dihasilkan produk fragmen kation elektron genap dan radikal netral, hanya kation yang terdeteksi.

2. Jika dua fragmentasi membelah ion elektron ganjil, baik secara simultan dan berurutan, produk merupakan kation elektron ganjil dan fragmen elektron netral.

3. Jika satu (atau bahkan dua fragmentasi) dari pemutusan ion elektron genap, produk merupakan kation elektron genap dan fragmen netral.

4. ion elektron Ganjil juga dapat mengalami penataan ulang atom struktural (juga disebut skeletal) sebelum fragmentasi. Penyusunan ulang kadang-kadang diprediksi tapi sering membuat interpretasi spektra fragmen ion massa menjadi sulit.

5. Fragmen ion dapat menjalani fragmentasi tambahan untuk memberikan ion fragmen yang lebih kecil. Dalam hal penentuan struktur, ion fragmen yang paling penting adalah mereka yang memiliki m/z tinggi yang dihasilkan dari fragmentasi ion molekul. Identifikasi ion induk, ion menjalani fragmentasi, sebagai ion molekul atau fragmen ion menjalani fragmentasi berikutnya tidak selalu sederhana. Teknik spektral lebih canggih massa memfasilitasi identifikasi ini.

 

Gambar 8. Contoh mekanisme fragmentasi satu ikatan untuk ion elektron ganjil untuk memberikan ion elektron genal. Kation radikal dibuat oleh elektron dampak ionisasi seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5. Secara umum, fragmentasi terjadi satu ikatan dihapus dari lokasi radikal kation radikal. Setiap kail ikan panah menunjukkan migrasi elektron tunggal. Ketika dua panah datang bersama-sama, ikatan baru terbentuk; ketika dua panah bergerak terpisah, sebuah ikatan terputus. Garis putus-putus menunjukkan lokasi pemutusan.

Gambar 9. Contoh dua mekanisme fragmentasi untuk ion elektron ganjil untuk memberikan ion elektron ganjil. Kation radikal dibuat oleh elektron dampak ionisasi seperti yang ditunjukkan pada Gambar. Setiap panah menunjukkan migrasi elektron tunggal. Ketika dua panah bertemu, ikatan baru terbentuk; ketika dua panah bergerak terpisah, sebuah ikatan terputus. Garis putus-putus menunjukkan lokasi pemutusan.

Gambar 10. Contoh mekanisme fragmentasi satu ikatan ion elektron genap diciptakan oleh ionisasi kimia dengan CH ₅ ⁺ seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6. Setiap panah melengkung menunjukkan migrasi pasangan elektron. Garis putus-putus menunjukkan ikatan yang rusak. Fragmentasi biasanya terjadi melalui hilangnya sebuah molekul kecil yang stabil seperti air.

Penerapan mekanisme fragmentasi dari beberapa tinggi puncak fragmen m/z muncul di spektrum massa EI ditunjukkan pada Gambar 11, 12, dan 13 untuk keton, amina dan ester, masing-masing. Penulisam mekanisme dengan panah menggunakan Angka 8 dan 9 sebagai panduan.
 

Gambar 11. EI / MS dari 2-pentanone dengan penugasan beberapa satu ikatan dan dua perpecahan menggunakan mekanisme Angka 8 dan 9.

Gambar 12. EI / MS dari N-ethylbutylamine dengan penugasan beberapa satu ikatan perpecahan menggunakan salah satu mekanisme dalam Gambar 8.

Gambar 13. EI / MS etil butanoate (etil butirat) dengan penugasan beberapa satu dan dua ikatan perpecahan menggunakan mekanisme Angka 8 dan 9.

Fragmen ion yang umum dijumpai

Kegunaan Spektroskopi Massa

• Mengetahui komposisi unsur dari bahan yang dianalisa sehingga diketahui berat dan rumus molekulnya
• Mengetahui unsure senyawa baik senyawa organic maupun anorganik
• Untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif suatu kompleks
• Untuk penentuan struktur dari komponen permukaan padatan
• Untuk menentukan perbandingan isotop atom dalam suatu sampel

---

Demikian informasi mengenai Metode Spektroskopi dengan NMR dan MS. Bila ada kekurangan silahkan sampaikan pada bagian komentar dibawah. Terimakasih

DAFTAR PUSTAKA

1. Cresswell, C.J. 1982. Analisis Spektrum Senyawa Organik. Edisi kedua. Bandung: Penerbit ITB.
2. Dachriyanus. 2004. Analisis Struktur Senyawa Organik secara Spektroskopi. Padang: Andalas University Press. 
3. Pavia, L. D. 1979. Introduction to Spectroscopy a Guide for Students of Organic Chemistry. Philladelphia: Saunders College
4. Silverstein, R. M. 1986. Penyidikan Spektrometrik Senyawa Organik. Terjemahan A. J. Hatomo dan Anny Viktor Purba. Edisi ke-4. Jakarta: Penerbit Erlangga. 
5. Sudjadi. 1986. Metode Pemisahan. Yogyakarta: Penerbit Kanisius. 
6. Supratman, U. 2008. Elusidasi Struktur Senyawa Organik. Bandung: Penerbit Widya Padjadjaran.